学术研讨丨Wistar乳鼠局灶性皮质发育

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癫痫是神经系统疾病中仅次于脑血管病以外的第二大疾病，经手术治疗的癫痫患者中约有75%的儿童癫痫和约25%的成人癫痫由局灶性皮质发育不良(Focalcorticaldysplasia，FCD)引起。年国际抗癫痫联盟(ILAE)对FCD做出最新分类，认为胚胎期、婴儿早期任何后天获得性损害，包括外伤、炎症及缺血性损害等均可造成FCD。

本研究应用液氮冷冻方法建立FCD的Wistar乳鼠模型，并分析脑电图(EEG)及头颅核磁共振(MRI)特点，从而为进一步探讨人类FCD的诊断、治疗提供理论及实验依据。

材料与方法实验动物及来源

实验动物为Wistar孕鼠，~g；由河北医科大学动物实验中心提供，许可证：SCXK(冀)-1-，合格证编号：。在清洁条件下饲养，饲喂大鼠颗粒饲料，自由采食饮水，待其生产。以新生1dWistar乳鼠70只，体重5.~6.g为实验对象；整个实验过程对动物的处置均符合动物伦理学标准。

方法1模型建立

取产后1dWistar乳鼠70只随机分为两组，实验组60只和对照组10只。实验组采用液氮冷冻造模：碘伏消毒头皮，低温麻醉下头部矢状面正中切口长约1cm，以直径2mm液氮探针冷冻乳鼠颅骨，冷冻部位为前囟后4mm，中线左侧旁开2mm，依冷冻时间分为3个亚组(30、60、90s)每组各20只，操作完成后迅速缝合，复温后回笼饲养。对照组同实验组步骤。切开头皮后，室温探针同部位、同时间接触，但不冷冻，缝合复温后回笼饲养。

2脑电图记录

实验观察时间定为Wistar乳鼠造模后3周开始，至第8周实验终止，实验第8周行Wistar乳鼠硬膜外接触电极EEG检查，每只至少30min。

具体方法：10%水合氯醛0.3mL/gWistar乳鼠腹腔注射麻醉，俯卧位固定。头部碘伏消毒，于正中线切开头皮长约1.5cm，于前囟后6mm左侧中线旁开4mm牙科电钻颅骨打孔，放置硬脑膜外接触电极，左侧乳突皮下处插入参考电极，MSU生物信号定量分析系统上描记EEG活动。各参数如下设定：单位：mv，时间常数：0.1s，高频滤波：Hz，平滑滤波：5点，增益0倍，扫描速率：8div/s，采样速率：5ms，横向压缩：1∶1，纵向压缩：%，自动基线。检查结束后缝合头皮，回笼饲养。

3核磁共振

Wistar乳鼠造模第8周行头颅MRI检查，10%水合氯醛0.3mL/g腹腔注射麻醉。采用GE公司1.5T超导核磁，以膝关节线圈扫描Wistar鼠头部T1及T2像。扫描参数如下：O-AXT1SE序列：TR=ms、TE=minimum、Frex=×、Nex=2、Fov=12、thickness=3、spacly=0，O-AXT2FSE序列：TR=ms、TE=85ms、Frex=×、Nex=2、Fov=12、thickness=3、spacly=0。

4病理验证

Wistar乳鼠造模满8周，完成其他检查后，实验组与对照组Wistar乳鼠均行水合氯醛腹腔注射麻醉，主动脉以4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌流，断头取脑。石蜡包埋，切片苏木素-伊红染色，40倍和倍光镜观察照像。

5统计学方法

全部数据使用SPSS13.0统计学软件处理。计量资料满足正态性及方差齐性时使用方差分析S-N-K检验，不满足正态性或方差齐性时使用非参数检验，计数资料采用R×C表χ2检验。P值＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

实验组乳鼠造模后于哺乳期间共死亡12只，存活48只。分别为实验亚组30s死亡2只，60s死亡2只，90s死亡8只。对照组大鼠10只，无死亡。

病理学表现

光镜下观察对照组10只Wistar乳鼠脑组织切片，皮质6层结构分界清晰，细胞形态正常，无明显异常(图1)。34只实验组Wistar乳鼠脑组织切片可见皮层神经元层状结构紊乱，各层之间界限不清、层数减少；柱状结构紊乱，呈串珠样排列，极向紊乱。气球样细胞形态多样，胞体直径常＞μm，见图2a~c；另14只仅表现为神经元及胶质细胞细胞间隙扩大，见图3。

以ILAE提出FCD的分类定义为判定依据，各实验亚组典型病理学改变符合FCDⅢd型表现。

脑电图结果

对照组Wistar乳鼠EEG检查未见异常放电。实验组Wistar乳鼠发作间歇期EEG可见α波数量减少，频率加快，波形不整，调幅调节变差，慢波出现较少或无；棘波、棘慢波频繁发放，甚至出现阵发性或节律性的棘波活动，见图4、5。

30s亚组异常放电阳性率约33.3%，60s亚组异常放电阳性率约44.4%，90s亚组异常放电阳性率约50%，实验组大鼠异常放电阳性率平均为41.6%。各实验亚组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，但各实验亚组组间无统计学差异。见表1。

核磁共振表现

对照组10只Wistar乳鼠MRI均未见明显变化。实验组14只病理改变不明显，MRI未见明显异常；34只具有典型FCDⅢd型病理表现的Wistar乳鼠中有16只可见MRI阳性表现，其中30s亚组MRI阳性表现者2只，60s亚组7只，MRI表现为T1加权像显示稍可见皮质局灶性低信号，局部脑沟增宽伴灰白质交界不清，T2加权像显示皮质点状高信号；90s亚组7只鼠可见T1加权像显示脑皮层结构紊乱、塌陷，皮质局部低信号，灰白质交接模糊、皮层增厚；T2加权像显示皮质局灶性高信号，斑片灶异常信号区向脑室方向延伸，脑实质局部液化、萎缩。见图6、7。

MRI阴性率：实验组中30s亚组77.8%，60s亚组53.3%，90s30%，实验组鼠MRI平均阴性率52.9%。各实验亚组与对照组比较有统计学差异(P＜0.05)，但各实验亚组组间无统计学差异(表2)。

讨论

癫痫的病因学复杂，近年随着医学影像学技术的长足进步，尤其是高清晰度头颅核磁共振仪的使用，临床发现的FCD越来越多，但FCD发病原因及其致痫机制尚不明了，临床诊断、治疗困难较多。FCD已成为国内外学者的研究热点。

根据年ILAE的FCD最新分类，组织病理学表现为皮质分层障碍伴随出生早期任何后天获得性损害，如外伤、炎症及缺血性损害等，均可归类为FCDⅢd型。我们的模型采用新生1d乳鼠液氮冷冻脑皮层，符合出生后早期外伤条件；组织病理学可见大脑皮层的层状、柱状结构不良、异形细胞及气球样细胞表现。综上所述，可认为该动物模型符合FCDⅢd型。

研究认为FCD本身就是致痫灶，其EEG表现具有特征性，与以下因素有关：①FCD内巨大神经元为尚未成熟的神经锥体细胞，气球样细胞为异常胶质细胞，这些细胞存在大量异常的轴突及、突及异常的突触连接，细胞膜阻抗降低，钙离子内流异常增多，具有易兴奋的特点，异常放电多发；本实验EEG证实FCD区域棘波、棘慢波频繁发放，甚至出现阵发性或节律性的棘波活动；②FCD与周围的脑组织可形成异常的放电环路参与痫性放电扩布;人类FCD手术证实，术中切除FCD后仍可在FCD周围组织监测到痫性放电；③FCD内神经递质紊乱，主要表现为兴奋性和抑制性的失调，从而引起癫痫发作。本实验EEG显示α波数量减少，频率加快，波形不整，调幅调节变差，慢波出现较少或无，这些表现考虑由此引起。

本组实验显示，范围较小的FCD病灶MRI经常可见在某一脑沟出现局灶性皮质增厚、微小的皮质或皮质下高密度影，灰白质边界不清；范围较大的FCD病灶常伴有脑回增宽及脑沟形态不规则，在T2上多表现为病变相对应的白质中出现局灶性皮质增厚，并向侧脑室方向逐渐变细并延伸，在T2FLAIR成像上尤为清楚。这充分说明FCD是大脑皮层形成过程中，神经元的增殖、移行、皮层组建等正常程序受到干扰所致。

文献报道在人类约50%的局灶性癫痫患者，术后组织病理学诊断为FCD，但是术前头颅MRI检查未发现任何异常。本研究显示各实验亚组乳鼠模型中病理学结果均存在FCDⅢd型，平均52.9%(30%~77.8%)MRI无异常发现。我们认为，其原因在于FCD主要是神经元迁移障碍性疾病，FCD细胞成分与正常脑组织基本一致，尤其是FCD内含水比例无改变，氢原子核数多少也相似，导致FCD与正常脑组织的氢原子核共振信号强度差异不明显。因此，MRI无法把FCD与正常脑组织分开，呈阴性表现。如何提高FCD的影像学诊断阳性率，目前已成为FCD研究的主要方向。

综上所述，我们的研究成功建立FCDⅢd型乳鼠模型，其呈特异性的EEG及MRI表现，对进一步诊断与治疗人类FCD具有重要参考价值。

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