小鼠胶质母细胞瘤模型中神经胶质瘤干细胞的

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IF：9.

Publishedin.9.2

01Introduction

胶质母细胞瘤已显示依赖糖酵解作为能量来源。但是，最近的证据表明，至少有一部分具有干细胞样特性的神经胶质瘤细胞可以在氧化磷酸化后壮成长。尚不清楚两种代谢表型是否都支持肿瘤扩散，它们是否独立以及它们是否稳定。本研究通过使用同基因鼠神经胶质瘤干细胞（GSC）研究了这些问题。

我们发现，即使是同基因的GSCs也表现出代谢特征的异质性，不仅能够通过有氧糖酵解而且能够通过氧化磷酸化满足其生物能需求。这些细胞的代谢偏好进一步受到诸如缺氧的环境因素的影响。我们的结果表明，两种代谢表型都可以在给定的肿瘤中共存，因此，它们突出了胶质母细胞瘤中组合代谢靶向而非单一能量途径靶向的需求。

02Rresult

等基因小鼠GSC的建立与表征

为了研究GSCs在肿瘤传播过程中的代谢特征，我们利用了基于表达H-Ras的Ink4a/arf缺失神经干/祖细胞(NS/PCs)的小鼠模型为了研究GSCs在肿瘤增殖过程中的代谢特征，我们使用了基于表达H-Ras癌蛋白和荧光报告基因dsRed或湿霉素选择盒的Ink4a/Arf缺失神经干祖细胞(NS/PCs)的小鼠模型。在本模型中，将H-Ras转导的NS/PCs作为GICs（胶质瘤起始细胞）植入野生型小鼠前脑。

此外，从胶质瘤繁殖后期分离出来的细胞，它们与同基因环境相互作用，克服了不同类型的环境压力，可以通过荧光或抗生素选择进行分类，然后在干细胞培养条件下培养，以丰富真正的GSC群体（补充图S1）。

为了检查GIC和GSC之间的生物学差异，我们首先研究了这些细胞以球体形式扩展的能力，这被认为反映了体内肿瘤的传播潜力。

补充图1

即使在无血清、添加生长因子的NS/PC培养基(NSM)中，GSCs形成的球体的生长也明显大于GICs形成的球体(图1A，B)。

在不含血清，也不含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的条件下培养，GSCs的球形生长程度明显高于GICs(图1A,B)，这也暗示了增长因素独立的扩张潜力的增加。

对于GIC-R/GSC-R群体，这种差异最为明显，表明体内传代过程中的重塑作用更强。

因此，为了研究GSCs的代谢特征，我们利用了先前从GIC-R建立的2个克隆群体，它们的细胞外酸化潜能不同的群体：

GICB，具有更高的线粒体储备，并且对氧化磷酸化的依赖性更高。

GICA，具有更高酸化能力和整体糖酵解代谢的群体。

从由GICA或GICB细胞引发的肿瘤中分选出的DsRed阳性细胞分别命名为GSCA和GSCB。

来自GSCA和GSCB种群的单细胞能够形成球体（图1C），一种能够反映体外自我更新潜力的能力。

免疫荧光分析显示，在干细胞培养条件下，两种类型的细胞未成熟细胞标记nestin均呈阳性，并能在BMP4暴露下分化为神经元系(βIII-微管蛋白阳性)和星形细胞(胶质纤维酸性蛋白[GFAP]阳性)(图1D)。

植入野生型小鼠的前脑后，两个GSC种群均形成了侵袭性脑肿瘤，其渗透率为％（图1E）。

组织学检查显示，肿瘤浸润到正常脑组织，出血和坏死，以及由任一细胞类型形成的肿瘤的高增殖指数（图1F）。

图1

这些结果证实了GSCAA和GSCAB细胞均具有干细胞特性，包括成球能力，分化能力和高致瘤性，其中GSCAA细胞在体外具有略高的自我更新能力。

GSC的代谢特征

接下来我们询问GSCs是否再现了GICs的代谢异质性。

与GSCB细胞相比，来源于糖酵解GICA细胞形成的肿瘤的GSCA细胞，其荧光葡萄糖模拟物2-NBDG的摄取明显更高(图2A,B)。

与GSCB细胞相比，GSCA细胞也表现出明显更高的乳酸产量(图2C)。

与GSCa细胞相比，GSCB细胞也有更高的ATP含量(图2D)，消耗更多的谷氨酰胺(图2E)，产生更多的NH4+(图2F)。

分子水平上,大量的糖酵解的关键酶——包括HK2，PKM2(磷酸化和非磷酸化形式),GSCA细胞的PDK1和LDH大于GSCB细胞，或未转换Ink4a/arfnullNS/PCs(图2G)，与GSCA和GSCB细胞的代谢谱一致。

图2

因此，我们发现GSCs概括了相应GICs的代谢特征和异质性。

代谢抑制剂对GSCs的影响

鉴于目前正在研究几种屈光性癌症的能量途径靶向，我们接下来检查了代谢抑制剂对GSCA和B细胞的影响。

ECAR被认为是糖酵解的指标，暴露于葡萄糖模拟物2-DG后，在GSCA细胞中显著减弱(图3A)。

在两个细胞群中，OCR不受2-DG的影响(图3B)。

相比之下，寡霉素19抑制线粒体ATP合酶或苯乙双胍抑制复合物I可导致两个克隆的OCR降低(图3D,F)，尽管这种效应在GSCB细胞中更为明显。

寡霉素和苯乙双胍也诱导了GSCB细胞的ECAR升高(图3C,E)，提示GSCB细胞在抑制氧化磷酸化后可能发生糖酵解补偿。

图3

确定了GSC对代谢抑制剂2-DG，寡霉素和苯乙双胍的即时反应后，我们接下来研究了用这些药物长期治疗的效果。

用2-DG抑制糖酵解会导致GSCA和B细胞的乳酸产生显着减少，而GSCA的减少更为明显（图4A），两个细胞中的ATP含量略有下降（图4B）。

与GSCB细胞相比，2-DG更能抑制GSCA细胞形成的球的生长(图4C)。

相比之下，寡霉素和苯乙双胍显著增加了GSCB的乳酸产量，显著降低了两种GSCs的ATP含量(图4D，E，G，H)。

与这些结果相一致的是，与GSCa细胞相比，氧化磷酸化抑制对GSCB细胞的球生长的减弱程度更大(图4F，I)，即使是寡霉素和苯乙双胍都不能完全抑制GSCB细胞形成的球的生长。

图4

综上所述，这些数据表明，抑制糖酵解可以有效地抑制GSCA细胞的球形生长，而抑制氧化磷酸化则在更大程度上抑制GSCB细胞的球形生长。然而，在GSCB细胞中，寡霉素和苯乙双胍的作用也被糖酵解的增加部分补偿。

GSCs对缺氧的适应和代谢的灵活性

考虑到氧化磷酸化抑制剂在GSCB细胞中诱导了明显的糖酵解补偿，我们接下来检查了限制氧消耗的其他条件是否也会有同样的效果。

众所周知，胶质母细胞瘤有低氧区域，并且低氧区域被认为有利于癌症干细胞和构成GSC生态位。

因此，我们研究了缺氧是否会影响GSCB细胞的代谢特性。

与常氧条件下相比，急性暴露于1%的O2会导致GSCA和B细胞的乳酸产量增加，但这种增加在GSCB细胞中更为明显，而且开始得更早(补充图S4A)。

ATP含量在GSCA细胞中不受缺氧影响，而在GSCB细胞中则略有下降(图5A)。

图5

补充图4

这些数据表明，GSCB细胞在几个小时内通过转向糖酵解来适应缺氧。

接下来我们检查了长时间(4天)暴露于缺氧对GSCB细胞的影响。

虽然GSCA细胞只显示乳酸产量略有增加，但GSCB细胞在该参数中显示了显著增加，达到了与GSCA细胞相似的水平(图5B)。

转录水平分析显示，特异性于GSCB的Pkm2和Ldha丰度显著增加(图5C)，而Hk2和Pdk1在两个克隆中显著增加，GSCB的增加更为显著(补充图S4B)。

免疫印迹分析证实了糖酵解酶蛋白水平的这种趋势，在GSCB细胞暴露于低氧环境4天后，HK2、PKM2(磷酸化和非磷酸化形式)、PDK1和LDH显著上调(图5D)。

尽管所有处理在低氧条件下都取得了具有统计学意义的显著效果，但GSCB细胞对代谢抑制剂的敏感性在低氧条件下明显受到影响，球形生长对2-DG更敏感(图5E)，而对苯乙双胍更不敏感(图5F)。

值得注意的是，GSCA细胞在缺氧条件下糖酵解略有增加，而球形生长的GSCA细胞对苯乙双胍的抗性也增强了(图5F)。

低氧诱导的GSCB细胞乳酸产量增加是可逆的，当细胞恢复到常氧状态时，乳酸值恢复到基线水平(图6A)。

缺氧诱导的HK2、PKM2、PDK1和LDH的上调也是可逆的(图6B)。

GSCA也显示了糖酵解酶丰度的可逆变化，但这并没有导致乳酸产量的显著增加(图6A，B)。

对在常氧、低氧或交替条件下培养的每个GSC的细胞内代谢物进行分析，然后进行主成分(PC)分析，发现GSCB和a在基础条件下沿PC1有明显的聚类(图6C)。

PC1轴的因子负荷评估显示，几种氨基酸，包括Thr、Val、Ile、Pro和NAD+，与PC1具有高度相关性(图6C)。

此外，这两种细胞在基底状态也沿PC2出现了轻微的分离。低氧暴露导致PC2组分的GSCB向GSCa表型的可逆转移，主要原因是几种糖酵解和磷酸戊糖途径(PPP)中间体(图6)。

图6

03Conclusions

总之，我们已经表明，即使是同基因的GSC，其代谢特征也可能是异质的，不仅能够通过有氧糖酵解而且能够通过氧化磷酸化来满足其生物能需求。它们的代谢偏好进一步受到诸如缺氧的环境因素的影响。我们的发现表明，两种代谢表型都可以在肿瘤中共存，因此，它们强调了在胶质母细胞瘤的治疗中需要组合靶向而非单个能量途径靶向。

Rreference：Metabolicheterogeneityandplasticityofgliomastemcellsinamouseglioblastomamodel

PMID:

DOI：10./neuonc/nox

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