肿瘤免疫治疗之CART的精准打击VS肿

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第一部分：CAR-T细胞简述

CAR-T（ChimericantigenreceptorT-cellImmunotherapy）疗法，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过不断的优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，目前被广泛应用于血液肿瘤治疗中，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

一、什么是CAR-T细胞？

简单来说，来自病人自身的T淋巴细胞在分离出来后，通过基因转导使T淋巴细胞表达嵌合抗原受体（Chimericantigenreceptor，CAR），再经过纯化、扩增后回输到体内使其特异性识别及杀伤肿瘤细胞，CAR-T细胞是改造后的自身细胞，故其排异反应小、患者耐受性好，并且经过改造方法的多次迭代，它能克服癌症的免疫逃逸机制、激活特异性免疫反应，靶向且相对持久地杀伤肿瘤细胞。

图1.CAR-T制备流程图

二、CAR-T的发展历程

随着CAR技术不断革新，已经历五代更迭，但其主要结构包括三个部分：一个通过抗体衍生的抗原识别位点（如识别CD19的单链抗体序列scFv），一个跨膜的铰链区，一个T细胞激活结构域（CD3ζ）以及胞内可提供共刺激信号结构域（CD28/4-1BB）。其中CAR胞外抗原结合域具有特异性识别特定肿瘤相关抗原的作用，随后通过胞内信号的传导激活T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的目的。

图2.CAR-T结构示意图

第一代CAR设计结构简单，但缺少共刺激结构域，仅引入CD3ζ中基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM）域的磷酸化来启动激活级联反应，但是该信号不足以激活静止的T细胞，使得CAR-T细胞无法良好活化及扩增；第二代CAR在之前的基础上增加了一个共刺激结构域CD28或者4-1BB，CAR-T的活化及增殖问题得到显著改善；第三代CAR包含两个共刺激结构域，有临床实验数据显示其在CAR-T细胞的活化上及持久作用上较二代更佳，但也有研究表明三代CAR可能造成T细胞刺激阈值降低，导致细胞因子过量释放的危险。第四代CAR-T细胞又被称为TRUCKT细胞(T-cellsredirectedforuniversalcytokinekilling)，既具有共刺激因子又具有促炎因子，例如白介素IL-12，从而提高T细胞功效，并通过修饰肿瘤微环境，募集并活化其他免疫细胞进行免疫反应。目前，四代CAR-T疗法已经在包括神经母细胞瘤在内的实体瘤治疗的临床试验中开展。第五代的CAR的设计旨在同时激活TCR，共刺激域CD28，和细胞因子三重信号，可增强其增殖，存活和抗肿瘤活性。

图3.五代CAR-T的结构设计示意图

第二部分：CAR-T细胞的治疗现状与困境

虽然目前来看，CAR-T细胞疗法在B细胞急性淋巴白血病和B细胞淋巴瘤患者的早期临床试验中取得成功，为复发难治性患者提供新的治疗选择，根据这些临床试验结果，FDA迅速批准了抗CD19CAR-T细胞产品（Kymriah和Yescarta），用于治疗ALL及部分B细胞淋巴瘤。然而，这些药品使用经验表明，由于CAR-T细胞持久性差以及肿瘤细胞抗原丢失等原因，导致肿瘤细胞在CAR-T治疗中耐受，从而导致治疗后的复发，大约30%-50%接受CD19-CAR-T治疗后获得缓解的患者病情会再次复发，并且复发大多发生在接受治疗后一年内。此外，还有约10%-20%的患者在接受CAR-T治疗后未能获得缓解，年发表在naturereviewsclinicaloncology杂志上的一篇综述对治疗后疾病复发的耐药机制进行了深度讨论，总结出治疗中的常见障碍。

障碍一：未能达到缓解

（1）CAR-T细胞的生产首先，考虑到需要治疗的大多数癌症具有侵袭性，及时成功地生产和回输CAR-T细胞仍然是CAR-T细胞疗法的障碍，这一过程中的第一道障碍是T细胞的收集，可能收集不到足够的T细胞，即使成功收集了T细胞，例如在产品制造失败的情况下，患者也可能无法接受治疗。在一项I期临床研究中，分析了抗CD19CAR-T细胞疗法治疗的儿科患者的基线绝对淋巴细胞计数（absolutelymphocytecounts，ALC），中位ALC为1,细胞/μl（范围–4,细胞/μl），这表明ALCs在正常生理范围内的患者更易于被选择接受CD19CAR-T的治疗。但随着CAR-T细胞制造的改进可能会降低细胞收集的限制，美国国家癌症研究所（NCI）的经验表明，制造CD3+细胞计数≥cell/μl的CAR-T细胞产品是可行的。除了细胞数，还有很多其他因素与CAR-T的生产及质量相关，例如有研究报道，先前接受化疗可导致后续CAR-T细胞产生数量不足或质量较差。此外，临床数据表明，事先用环磷酰胺和阿糖胞苷治疗可选择性减少与CAR-T细胞扩增相关的早期谱系T细胞。CAR-T细胞制造过程的其他细节也可能会影响所得产品的质量，进而影响后续的临床反应，例如当前的制造方案中T细胞受体（TCR）激活诱导的T细胞扩增的步骤。基于anti-CD3/anti-CD28免疫磁珠的扩增和基于anti-CD3抗体的扩增方案都用于FDA批准的抗CD19CAR-T细胞产品的生产中。此外，CAR构建体设计是另一个参数，可能会影响CAR-T细胞产品的特性以及修饰细胞的后续体内情况，包括其扩展动力学和持续时间。在临床试验中测试的大多数CAR-T细胞属于第二代，表示它们既包含TCR，也包含CD28或4-1BB（也称为CD）共刺激域。尽管临床前数据和对患者的观察结果表明CAR设计的这一方面显着影响产品的持久性，但是共刺激域对缓解率的影响尚未得到系统评价。此外，CAR设计的其他细节，例如抗原结合结构域的特定特征，细胞外铰链区的存在和结构以及跨膜结构域的特征，也可能会影响CAR-T细胞的属性。（2）CAR-T细胞的回输由于制造CAR-T细胞产品需要一定时间，未能在患者疾病进展或出现并发症之前及时回输的患者约20%-30%，因此未来需要尽可能缩短生产时间，达到更佳治疗效果。（3）CAR-T细胞的激活和扩增临床研究表明，尽管输注后细胞的活化和指数扩增是必不可少的，但实现有效治疗所需的CAR-T细胞剂量非常小，目前的剂量方案为0.2–5.0×CAR-T细胞/kg或每次总共回输0.1–2.5×CAR-T细胞，CAR-T细胞产物的质量和固有的T细胞表型可以影响输注后CAR-T细胞的行为。

障碍二：疾病复发

在输注CAR-T后12个月内，高达50％的前B细胞ALL患者发生疾病复发，主要有两种模式：（1）抗原阳性白细胞的早期复发；（2）与抗原丢失相关的晚期复发。（1）抗原阳性复发ALL的早期复发（通常在成功诱导缓解后的最初几个月内）通常与有限的CAR-T细胞持续性和（或）短暂的B细胞再生障碍有关，这提示由CAR-T细胞介导的对白血病的主动监测能力的丧失，主要与CAR-T细胞持久性相关，包括T细胞质量（可能取决于患者和背景）和初始T细胞表型（包括CD4+与CD8+T细胞的比例），此外，其他因素还有共刺激信号，有临床前研究报道表明，包含CD28共刺激域的CAR的持久性要比那些含有4-1BB共刺激域的CAR持久性差。（2）抗原丢失或调节相关的免疫逃逸导致抗原丢失或下调的机制有很多，例如CD19分子的选择性剪接，该剪接产生CD19同工型，破坏靶抗原决定簇和/或降低细胞表面表达，以及中断CD19向细胞表面的转运。还有与治疗相关的抗原丢失或调节无关，固有的肿瘤异质性也容易导致抗原阴性克隆的出现。人们认为CD19在所有B前细胞ALL克隆上都普遍表达，并且在靶向CD19的治疗中抗原阴性亚克隆的形成。一些研究的数据表明，恶性B细胞祖细胞可能是CD19–，特别是在BCR–ABL1ALL患者中。谱系转换是逃避CAR-T细胞的另一种机制，患者在ALL特异性治疗后已向AML转化，反之亦然，除此之外，抗原的突变、CD19分子膜转运障碍，CAR-T细胞的胞啃作用等，均可导致抗原的丢失或密度减少，导致疾病的复发。

障碍三：毒性作用

在CAR-T细胞治疗中最常见的毒性有细胞因子释放综合症（CRS）、神经毒性等，在过去的几年里，严重甚至致命的CRS和其他毒性是某些患者持久性CAR-T细胞诱导的缓解的障碍，所以优化CAR-T疗法安全性的方法也急需解决。目前有关CRS管理的文献主要基于抗CD19CAR-T细胞疗法试验的经验。对于靶向新型抗原，重要的是认识到并非所有的CRS病例都是相同的，因此，干预策略可能会有所不同。例如，在未实施任何早期干预的情况下，在抗CD22CAR-T细胞治疗后，观察到的CRS似乎不如抗CD19CAR-T细胞严重。然而，靶向CD22抗原的新型毒性，如临床相关性凝血性疾病，需要不同的治疗方法。

障碍四：适应症局限

目前来看，将CAR-T疗法的应用扩展其它癌症中还存在很多障碍。尽管FDA已经批准Kymriah和Yescarta用于治疗复发和/或难治性大B细胞淋巴瘤，然而，治疗的缓解率并不高（仅30％和54％）。除了血液肿瘤，开发用于治疗实体瘤的有效CAR-T疗法面临着一系列独特的挑战，固有的肿瘤异质性是一个关键的问题。此外，克服可能使CAR-T细胞失活的免疫抑制肿瘤微环境对实体瘤CAR-T治疗也很重要，也是CAR-T治疗实体瘤路程中的障碍。

第三部分：CAR-T细胞治疗的最新进展及未来展望

CAR-T细胞在治疗血液系统恶性肿瘤患者中显示出了巨大的成功，但是，要实现CAR-T细胞更广泛的治疗应用，就必须在多个层面上采用工程方法来提高功效和安全性。今年发表在CancerCell杂志上的一篇综述EngineeringCAR-TCellsforNext-GenerationCancerTherapy，论述了如何对CAR-T细胞进行工程化修饰以用作新一代的癌症疗法。

图4.CAR-T细胞的工程化改造示意图

一、CAR蛋白的设计

在CAR蛋白的设计上，除了前面已经概述的CAR设计的演变之外，还可以从其他几个方向来提高CAR-T细胞疗法的功效和安全性。（1）针对逻辑门控T细胞激活的组合性抗原活化布尔逻辑门已被CAR-T细胞用于多种抗原的组合检测，以提高其安全性和抗肿瘤功效。AND门逻辑需要两种不同的抗原共存才能激活CAR-T细胞，并且这种设计降低了健康组织中脱靶识别或“脱靶，脱瘤”毒性的风险表达与肿瘤细胞遭受附带损害的相同抗原。此外，还有AND-NOT逻辑的CAR-T细胞，可以防止对健康细胞的毒性作用。该策略利用靶向健康组织上发现的抗原的抑制性CAR（iCAR），并将其与靶向TAA的激活性CAR配对。AND和AND-NOT逻辑可以通过提高特异性来提高CAR-T细胞的安全性，而OR门逻辑已被用于通过规避抗原逃逸或肿瘤细胞失去目标表位的方式来提高抗肿瘤功效。OR门CAR可以识别两种不同的TAA，并且任何一种抗原的结合都会诱导T细胞活化。（2）“开启/关闭”开关的可控性和安全性为了提高安全性和可控制性而对CAR进行的改装，也采用了外部可感应或自调节式ON/OFF开关的形式。传统的CAR-T细胞永远处于“ON”的状态，受到刺激后给出信号反应。如此以来，在用CAR-T细胞治疗的患者中容易出现毒副作用，常见的例子包括细胞因子释放综合征（CRS）、与CAR相关的脑病综合征（CRES）、肿瘤溶解综合征和过敏反应等。故在空间和时间上调节CAR-T细胞活性可以预防或显着降低与CAR-T细胞疗法有关的毒性的严重性，但同时保持其抗肿瘤功效。①调节CAR-T细胞活性的一种方法是通过调节CAR蛋白本身的稳定性或构象来调节工程化T细胞表面功能性CAR的存在。在此类系统中，默认状态为“关闭”，并且需要去除或灭活降解标签才能稳定CAR蛋白，从而在抗原刺激后实现CAR介导的T细胞活化。②除了调节蛋白质的半衰期外，控制CAR蛋白质的构象还可以调节功能性CAR的可用性，从而使受体仅在特定条件下才具有信号传递能力。例如，CAR的抗原结合域可以被内置的抑制物“掩盖”，这样只有在抑制肽被TME中常见的蛋白酶切割后，才能获得CAR的功能构象，进而发挥功能。（3）适配器依赖性的CARs工程改造T细胞表达一种受体，该受体必须在合成复合物之前被其他蛋白质组分补充能够将抗原识别转化为T细胞活化。

二、改进表达CAR的细胞

除了对CAR蛋白本身进行工程改造以外，在细胞水平上调节T细胞活性的工程改造方法也可以显着影响治疗效果和安全性。例如，mRNA瞬时电转而非病毒整合产生的瞬时CAR蛋白表达可减轻因为其识别健康组织的CAR诱导的毒性；与自杀基因（例如HSK-TV，iCasp9，CD20和tEGFR）的共表达可在发生不良事件时诱导T细胞死亡，从而中止治疗。此外，作为CAR稳定性和功能的翻译后调控的替代方法，转录调控可以提供另一个可调节方式，来提高CAR-T细胞的安全。例如，在Tet-ON系统中，小分子强力霉素（Dox）充当``ON开关，仅在Dox存在的情况下，逆四环素反式激活蛋白（rtTA）才能诱导CAR表达。此外，也可使用对缺氧诱导因子-1a（hypoxia-induciblefactor，HIF）有反应的诱导型启动子来实现对肿瘤相关环境的反应，即仅在低氧环境下才激活CAR表达，从而达到控制CAR特定环境下的表达。此外，位点特异性的CAR转基因插入及异基因兼容工程化修饰上也有很多研究进展，有研究证明，由CRISPR-Cas9介导的CD19CAR转基因插入TCRaconstant（TRAC）基因座的结果与逆转录病毒介导的随机CAR-转基因插入方式相比，CAR-T细胞具有更强的体内功能。同时，通过基因编辑技术还可以消除内源基因，以支持同种异体T细胞疗法，这样在难以从高度治疗后的晚期疾病患者体内获得足够的高质量T细胞时，可以使用健康供体的T细胞产品。同种异体T细胞转移需要消除内源性TCR以防止移植物抗宿主病（GvHD），去除I类主要组织相容性复合物（MHC-1）以最大程度地减少同种异体移植排斥。除了预防GvHD，基因编辑还被用来保护CAR-T细胞免于淋巴结清扫，这是在CAR-T细胞输注前进行的常规预处理，以提高细胞的功效。基因编辑技术还被用于消除T细胞活性的负调控因子的表达。肿瘤细胞经常上调免疫检查点受体的配体，例如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和在T细胞上表达的PD-1，从而导致TME中T细胞活性受到抑制。利用基因编辑技术敲除T细胞上检查点受体的表达来维持CAR-T细胞活性。除PD-1外，有研究显示敲除代谢调节剂REGNASE-1和CD3信号调节剂二酰基甘油神经激酶（DGK）也可以在体外和体内增强T细胞功能。最后，关于降低CAR-T细胞毒副作用，有报道使用CRISPR-Cas9介导的敲除作用破坏CRS相关细胞因子（如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF））的表达，可以提高CAR-T细胞的安全性。尽管CAR-T细胞已显示出对血液系统恶性肿瘤的卓越的治疗功效，但其针对实体瘤的靶向性却受到许多挑战的困扰。除抗原异质性外，肿瘤细胞还在TME中产生免疫抑制因子，这种抑制性环境还与诸如MDSCs和Tregs等免疫抑制细胞类型进一步加强抑制作用。在TME中常见的免疫抑制可溶性因子中，转化生长因子b（TGF-b）是一种有效的细胞因子，可驱动T细胞分化为Treg，并使巨噬细胞极化为免疫抑制M2表型。所以根据这种特点，工程上设计出TGF-b反应性CAR，可以感测可溶性因子，重新连接T细胞以将抑制信号转化为抗肿瘤活性的触发因子。TGF-b反应性CAR-T细胞在可溶性TGF-b的存在下可以增殖并产生T辅助1型（Th1）相关的细胞因子，并保护附近的细胞免受TGF-b的抑制作用通过TGF-b隔离和旁分泌Th1细胞因子信号转导的联合作用。T细胞代谢或T细胞利用营养源的方式对其分化状态和效应功能具有相应的影响。CAR蛋白的结构可能会对CAR-T细胞的代谢谱产生影响。有报道表达具有4-1BB共刺激的CAR的T细胞有利于中央记忆表型的脂肪酸的氧化分解，并伴随着增殖和持久性的增强，而表达CD28共同刺激的CAR的T细胞具有效应记忆表型的好氧糖酵解的特性，T细胞代谢和功能之间有密切关系，重新编程CAR-T细胞的代谢模式可以潜在地提高其临床疗效。此外，T细胞的分化状态会影响其寿命和功效，从而促进CAR-T细胞生产中特定T细胞亚型的分布情况。通常，选择分化程度较低的表型（naive(TN),memorystem(TSCM),andcentralmemory(TCM)）比起分化程度更高的对应物（effector(TE)andeffectormemory(TEM)）具有更高的移植率和功效。CAR蛋白中不同的共刺激结构域可以影响T细胞亚型分布：CD28共刺激促进TEM表型，而4-1BB则可以导致TCM富集。

三、工程性T细胞与肿瘤/TME的相互作用

TME介导的免疫逃避和免疫抑制导致在实体瘤中观察到的CAR-T细胞治疗效果差。主要包括（1）实体肿瘤对免疫细胞的穿透具有物理屏障；（2）免疫检查点配体上调；（3）肿瘤前基质微环境；（4）丰富的免疫抑制因子和促转移相关可溶性因子；（5）调节趋化因子的表达以优先募集具有免疫抑制表型的细胞。这些因素反过来推动了对TME元件起反应以增强CAR-T细胞功效的CAR-T细胞的设计。

图5.工程化CAR-T细胞克服TME介导的免疫逃避和抑制

免疫细胞浸润能力差，严重阻碍了CAR-T细胞疗法在实体瘤中的功效，对CAR-T细胞进行改造以使其在TME中过度表达的趋化因子受体，类似肿瘤的防御机制。例如，靶向GD2和间皮素的CAR-T细胞已经过工程改造，可同时表达CCR2b（CCL2趋化因子受体的主要同工型），导致T细胞向表达CCL2的神经母细胞瘤和恶性胸膜间皮瘤异种移植物归巢能力增强。细胞因子作为信号蛋白，具有急剧增强或减弱CAR-T细胞功能的能力。与免疫刺激性细胞因子共表达，可以显着增强免疫抑制TME中CAR-T细胞的增殖，存活和效应功能。但是同时，免疫刺激性细胞因子的组成型过表达也会增加毒性。这种情况下可以调控策略，例如使用诱导型启动子，调节细胞因子的产生和相关的毒性。除了上述相关的工程策略，文中提出也可以通过破坏免疫抑制轴，例如PD-1和PD-L1等，使CAR-T细胞疗法发挥出更强大的潜力。最后，肿瘤擅长选择性吸引或逃避包括CAR-T细胞在内的白细胞亚群，以促进免疫调节或抑制。增强CAR-T细胞治疗功效的另一种方法是通过重塑肿瘤细胞组成和表型来逆转这种免疫抑制微环境。为了实现这一目标，CAR-T细胞经过了工程改造，可以分泌细胞因子或其他可溶因子，以旁分泌或内分泌的方式诱导TME重塑，增强CAR-T细胞杀伤肿瘤的能力。

参考文献：

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