慢病毒造血干细胞基因治疗对异染性脑白质营

引言：

异染性脑白质营养不良(MLD)是由于芳香基硫酸酯酶(ARSA)缺乏导致的神经退行性溶酶体储积症。该疾病主要影响儿童，不同程度地导致儿童夭折。在之前异染性脑白质营养不良小鼠模型研究中，我们使用了慢病毒载体(LV)，将功能性芳香基硫酸酯酶基因引入造血干细胞材料(HSCs)中，试验显示经改造的造血干细胞回输后能阻止并修正疾病在动物体内的表现。为确定基因治疗方案的安全性以及对早期异染性脑白质营养不良患者的治疗效果，我们设计了一/二期临床试验。

方法：

我们优化了临床规模的慢病毒(LV)生产和造血干细胞(HSCs)的转染。对三名存在芳香基硫酸酶缺乏并有异染性脑白质营养不良基因，但属于早期或尚未出现症状的儿童进行了治疗，他们均有不同程度患有相同疾病的哥哥姐姐。将患者的造血干细胞用带芳香基硫酸酶基因的慢病毒转染。

患者使用清髓预处理方案后，回输经改造的造血干细胞。治疗后24个月进行临床及客观评估。对骨髓和外周血的造血细胞载体整合分布进行分子随访。

结论：

所有患者随时检测表明，骨髓和外周血内回输的造血干细胞植入高度稳定，载体中有40-85%骨髓产生的造血细胞。由于较高的基因标记，芳香基硫酸酯酶活性得以重组，在血液和脑脊髓液中达到正常值。

对超过个慢病毒整合点的分析表明回输细胞较高的多细胞植入保持了较高的基因印记，无反常克隆行为。治疗后较长间隔的原始和成熟骨髓、B和T细胞抽样中发现共享的多个整合点位，说明造血干细胞和有效回输和植入。上述发现显示了明显的治疗效果，因为全体受治患者疾病均不再进展，即使在根据其同胞病情预测的发病时间之后。

讨论：

我们的基因治疗方案保证了回输造血干细胞较高的植入水平，无载体导致的基因毒性证据。芳香基硫酸酯酶在三名经治疗患者脑脊髓液中的重组以及对退行性神经疾病发展的阻断表明，移植的细胞或其后代细胞可在神经系统中播种并实现治疗后的酶活力。尽管我们的数据令人振奋，仍需要对患者进行长期随访，以确定该基因治疗方案对异染性脑白质营养不良的完整治疗潜力。此外，我们的数据将慢病毒基因移植作为完全改造人类造血系统的可能方式-这也是探寻治疗其他疾病的方式。

造血干细胞基因治疗可以阻断易染性脑白质营养不良的进展

MLD01号患者在基因治疗前后的脑核磁共振影像。患者在治疗后两年表现基本正常。相反，未治疗的晚婴型MLD脑部显示严重脱髓鞘伴弥漫性萎缩。（上图）T2快速自旋回波核磁影像。（下图）FLAIR核磁影像。

文献中的图表

图一：造血干细胞移植后患者的基因标注.

图二：造血干细胞移植后患者的芳香基硫酸酯酶表达.

图三：MLD患者造血干细胞移植后的临床随访

图四：慢病毒染色体整合情况

图五：一般插入点位分析.

图六：干细胞标记与克隆动态.

补充材料

材料与方法

图：S1toS22

表：S1toS19

造血干细胞基因治疗可以阻断易染性脑白质营养不良的进展。患者在基因治疗前后的脑核磁共振影像。患者在治疗后两年表现基本正常。相反，未治疗的晚婴型MLD脑部显示严重脱髓鞘伴弥漫性萎缩。（上图）T2快速自旋回波核磁影像。（下图）FLAIR核磁影像。

概述

异染性脑白质营养不良（MLD）是由于芳香基硫酸酯酶（ARSA）缺乏导致的遗传性溶酶体储积症。MLD患者显示了进行性的动作和意识损伤，在出现症状后数年死亡。我们通过慢病毒载体将功能芳香基硫酸酯酶基因植入三名未出现症状但显示有晚婴型MLD基因、生化和神经生理证据的患者的造血干细胞（HSCs）中。回输修改基因的造血干细胞之后，患者显示了广泛和稳定的芳香基硫酸酯酶基因替换，在整个造血系统和脑脊髓液中出现高的酶表达。对载体整合的分析未显示异常克隆。三名患者在预期出现症状的年龄后7-21个月未发病或进展。这些发现说明可使用慢病毒载体实现人类造血干细胞的广泛基因改造，同时这种方法可能治疗MLD患者。

异染性脑白质营养不良（MLD）是由于芳香基硫酸酯酶基因突变导致的隐性染色体溶酶体储积症，症状是芳香基硫酸酯酶缺乏。芳香基硫酸酯酶缺乏导致酶底物硫脂堆积在中枢神经的少突胶质细胞、小神经胶质和部分神经元及其周边神经系统的雪旺细胞和巨噬细胞中。酯酶的堆积导致广泛的脱髓鞘和神经退行，最终表现为严重的进行性动作和意识损伤。MLD根据症状出现年龄有不同的临床分型，晚婴型在出生后第二年出现症状，是最严重的疾病类型，并在出现症状后数年死亡。目前的治疗不能实质性延缓MLD的进展或死亡。针对溶酶储积症的造血干细胞移植和造血干细胞基因治疗研究基于有充分酶的造血后代细胞可以迁移至包括中枢神经在内的受影响组织，清除MLD患者的酯酶等储积物质，代偿修复剩余细胞。上述治疗由于移植细胞中功能基因表达程度的不同而对不同溶酶储积疾病类型的效果不同。实现高水平功能基因的替代对造血干细胞基因治疗非常重要。至今，经治疗的患者造血干细胞基因替代仍然有限。在MLD的小鼠模型中，我们展示了基于慢病毒载体的造血干细胞基因治疗能够阻断并修正疾病的进展，但造血干细胞移植则不能。这个结论是造血干细胞移植不能为MLD患者带来持续的治疗效果。基于慢病毒载体的造血干细胞基因治疗在造血干细胞后代细胞中引入广泛和超生理的功能ARSA基因表达，给予中枢神经和周边神经系统剩余细胞广泛的交叉修复治疗。但这一方案转化为临床方案仍有多重挑战，包括基因转运效率和安全性。尽管最初慢病毒改造的造血干细胞基因治疗试验中的两例X-连锁肾上腺脑白质（ALD）患者有稳定的标记（10-15%），但仍不清楚慢病毒是否能够在相关临床环境下转运的人类造血干细胞能够达到MLD基因治疗应用所要求的效率。载体的安全性也是基因载体用于临床的担忧，因为造血干细胞/后代细胞中染色体的载体整合有可能由于插入诱变引发白血病。尽管多项研究显示慢病毒由于其领先的设计和母体爱滋病毒的整合点位选择，有可能增加减少了基因毒性插入的风险，但是输入的造血干细胞母细胞总体整合负载的增加有可能抵消生物安全优势。

在最近的研究中，在一项一期和二期临床研究中，我们优化了培养的慢病毒基因植入人类造血干细胞的临床应用，并使用造血干细胞基因治疗方案治疗了九名发病早期的MLD患者。在此，我们报告首批三名经治疗患者中1号患者治疗后24个月，2号和3号患者治疗后18个月的随访结果。

结论

ARSA基因向MLD患者多向祖细胞（HSPCs）的体外有效载体转运

基于临床前研究ARSA需要超水平表达的疗效要求（8,9,21,22），对人类骨髓（BM）来源的CD34＋细胞进行了优化，达到了每个染色体至少2个载体拷贝数（图S1）。CD34＋细胞使用具有早期作用的细胞因子在无血清培养基中进行刺激，然后使用纯化的第三代慢病毒(LV)在磷酸甘油酸激酶启动子控制下进行人类ARSAcDNA编码（图S2）。通过批量液体培养、克隆形成试验和嵌合Rag2?/?gchain?/?的小鼠增殖获得的经治疗的细胞后代细胞计算的基因组（VCN）。

图S3和表S1与S2报告了慢病毒生产制造流程（流程图、主要步骤和产量）以及本次研究的符合药品生产质量管理规范（GMP）的测试说明。

人类细胞基因转运流程优化完成后，我们设计了造血干细胞基因治疗临床试验，使用烷化剂白消安对患者进行清髓预处理后，回输经ARSA编码转录的慢病毒植入来自MLD患者的自体造血干细胞（图S4）。由于MLD患者通常有残余的无功能ARSA蛋白，对ARSA不容易有免疫反应。我们的试验设计因此不考虑使用免疫抑制剂。

生化上存在ARSA缺乏病并携带晚婴型MLD突变的三名未出现症状的患者加入试验并得到了治疗，所有患者均有一名或多名两岁内发病的晚婴型MLD年长同胞（表S3）。加入试验时，鉴于患者无明显的疾病临床症状，仪器测试无异常（脑电图记录及/或脑部核磁共振影像），确定为发病前状态。在发病同胞发病年龄前2-12个月对患者进行治疗。

采集造血干细胞备用后二十至三十天，采集骨髓，使用标准免疫程序分离出CD34+细胞。根据上述方法导入患者的CD34+细胞。对细胞进行清洗、悬浮并保存在4℃，直到成功完成第一阶段快速品质控制测试（表S4）。

转录后的CD34+细胞被释放出来并通过静脉回输。回输后2到5周得到其他相关品质控制结果（表S4）。VCN从2.5到4.4，转录效率为90到97%，回输细胞所培养的后代细胞中，ARSA活性被重组到≥健康对照组测量值的10倍（图S1和表S5）。清髓预处理方案为，在回输造血干细胞基因治疗前的第四天到前一天，通过静脉注入调整剂量的白消安，（表S5），合计14次，最后一次白消安输入时间必须保证为≥回输前24小时。预处理方案的耐受较好。患者在移植前第九天到回输后45天之间经历嗜中性白细胞大量减少（绝对嗜中性白细胞计数/毫升）（图S5和表S5）。移植前预处理过程中不使用免疫抑制/淋巴毒性药物，未发现淋巴细胞计数减少或只有少量过渡性减少（图S5）。患者由于血小板减少和贫血，需要输液支持直至治疗后45天。此后，患者造血指标快速恢复到与其年龄相应的正常值。外周血和骨髓细胞类型组成、细胞学、染色体组型或免疫表型研究未发现异常增生或克隆副产品（图S5）。治疗后2到3周发现干细胞酶水平出现过渡性增多（国家癌症研究所/国家健康研究所普通毒性标准评级2级的最高值）。严重的不良事件包括两例中央静脉导管相关的感染，通过抗生素治疗迅速得到解决。任何时候不得检测出患者外周血中存在有复制能力的载体（RCLs），HIVGagp24抗体、ARSA抗体为阴性。

转录的造血干细胞祖细胞高植入率及持续的ARSA重组

移植后一个月，我们开始观察到任何时候检测所有患者，骨髓和外周血中高水平稳定的转录细胞植入率（图1A）。患者骨髓克隆形成细胞试验中载体染色体克隆率为45到80%（图1A）。最近随访时，来自患者骨髓的CD34+在细胞定量聚合酶链锁反应（PCR）中显示稳定的基因标记，VCN从0.9到1.9（图1B）。考虑到载体上细胞的分裂（估计来自患者骨髓的载体DNA克隆基因祖细胞百分比），上述数值代表植入的转录后CD34+细胞VCN为2到4，与测量的回输细胞载体后代细胞数据完全吻合。从抽样到整个随访，循环CD15+粒细胞和CD14+单核细胞、骨髓细胞和独立于骨髓的祖细胞中相应也观察到较高且稳定的基因标记（图1C）。观察到淋巴细胞基因标记逐步增加，快于B和NK细胞，慢于更长寿命的T细胞，这符合选择的预处理方案预期（图1C和图S6）。转录后造血干细胞导致的造血系统不同的增殖动力学是外周血单核细胞（PBMCs）基因标记水平不断增加的原因（图1D）。高水平的基因标记推动了与治疗最为相关的髓系（图二、A和B）和其他循环细胞（图S7、A和B）中ARSA活性的重组，从不足恢复到正常值以上。治疗后一个月就可以从所有检测样本（图7D）中的患者造血细胞中分离出ARSA蛋白（图S7C）。从患者细胞中分离出的酶能够水解载体的天然底层硫脂，具备完全功能性（从正常捐献者和经治疗的患者造血细胞中分离出0.mU芳香基硫酸酯酶水解了3.6T1.2nmol底层硫脂）。慢病毒mRNA原位杂交和合ARSA表达的荧光免疫检测显示包括较高的患者学细胞比例，与这些细胞定量聚合酶链式反应（PCR）检测到的较高VCN相符（图S8与表S6）。

图一：造血干细胞基因治疗后患者的基因标记

（A）对外周血和骨髓来源细胞克隆形成细胞试验中各克隆情况进行定量聚合酶链式反应（PCR）检测评估的转录细胞的植入率，使用慢病毒克隆占总监测克隆的百分比表示。

（B）（B到D）使用慢病毒复制份数/骨髓来源CD34+细胞定量聚合酶链式反应（PCR）检测到的人类染色体计数表达VCN（B），1号MLD患者分离出的各亚群（C），以及1号、2号和3号MLD患者外周血单核细胞总数（D）。

造血干细胞基因治疗后一年（1号MLD患者为2年）后，从三名患者脑脊髓液中分离出功能性ARSA在水平和活性上均与从健康供体样本相当，而在造血干细胞基因治疗前无法分离出ARSA蛋白（图2，C与D）。这些数据表明，在造血干细胞基因治疗后，造血系统存在稳定的正常值以上的ARSA表达，且中枢神经中的酶得以有效运送并具有生物活性。

造血干细胞基因治疗对MLD患者有治疗效果

对MLD01号患者在治疗后24个月，MLD02和03号患者在治疗后的18个月内进行了临床观察和客观评估。最近一次随访中，1号、2号和3号MLD患者年龄分别为39、30和25个月（表S3）。由于通常该病在24个月龄发病，且临床症状基本一致，尤其是患者的同胞中发病时间基本一致，我们在研究中，对三名患者预期发病年龄之后进行评估。由于对MLD01号患者的随访时间最长，且该患者预期发病时间更早，从该患者获得的信息最为丰富。该患者的两名兄长在18个月龄时出现神经运动退化，并不再能获得新的运动和认知技能。与晚婴型MLD自然发展一致，两名兄长在发病后病情迅速恶化，30个月龄时，达到MLD大动作功能评估六级（GMF-CMLD）损伤，瘫痪且无法支撑头部和身体（表S7）。相反，MLD01号患者在39个月龄仍能独立站立、并借助简单辅具行走和奔跑（别人的手或外部步行设备）(GMF-CMLD二级损伤)（表S7）。大动作功能（GMFM）评分从手术入选开始（GMFM分）提高到39个月龄的分，大大高于我们相同月龄晚婴型MLD评分表中记录的所有评分（平均为5.5），说明动作发展持续（图3A和表S8）。贝利婴幼儿发展量表的婴儿认知评估显示出发育年龄的正常IQ评分，所有测试时间均显示正常语言和认知能力（表S9），包括最后一次39个月的测试，而其同胞当时已经不能自主说话。治疗后，MLD01号患者之前的严重周边神经症状[神经传导速度（NCV）底线参数–11.5]获得改善（最后一次随访时NCV参数–7.1）（图3B）。脑部核磁共振显示最初评估时的轻







































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